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解决方案 | 核酸扩增技术

作者：无锡耐思生命科技股份有限公司 2023-01-06T15:06 (访问量:4931)

一、PCR：

PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis发明，至今仍广泛使用的DNA扩增技术。它通过高温解链、低温退火、中温扩增的过程，来实现目标片段DNA的指数级扩增。

PCR反应体系可以简单概括为：DNA模板（Template）、引物（Primer）、DNA聚合酶（Polymerase）、三磷酸核苷（dNTPs）及缓冲液。缓冲液中常含氯化镁等金属盐，并可能添加BSA、DTT、甲酰胺等助于聚合酶活性和模板解链的试剂，并以PreMix、MasterMix的形式商品化，耐思通用型核酸扩增试剂盒可满足常规PCR需求。

PCR热循环仪是实现PCR反应的外部硬件，通过程序化的温度控制，利用金属浴来按时加热、冷却PCR反应体系。DNA双链模板中的氢键在高温下断裂；温度降低后，体系中互补引物与模板单链重新形成氢键结合，从而产生粘性末端。DNA聚合酶辨识粘性末端结合后，在中等温度下以dNTP为原料在引物后延长DNA链。如此产生的DNA链在新的一轮循环中可以作为额外的模板重复扩增反应，若干循环后目标DN**段便实现指数级扩增。

实验案例：一个经典的实验室PCR实验

PCR体系的组成：DNA模板（<100ng）、上下游引物（2mM）、dNTPs（2mM）、DNA聚合酶MasterMix（2X）。PCR体系常为20μL或50μL的体积，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。一个典型的PCR程序如下：

二、qPCR、RT-PCR、数字PCR：

传统PCR技术仅在终点处检测产物，因此也叫终点PCR（End-point PCR），常用于克隆、测序及基因分型等。而与之相对应的，在整个反应中都检测目标序列荧光信号的技术称为实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR），简称qPCR。qPCR的检测能力、应用范围相对于终点PCR都有很大的提高。

qPCR中有嵌入或基于探针的荧光染料在循环中实时反应产物浓度。一系列从低到高浓度的DNA模板参照会与目标模板同步扩增，较高浓度的DNA模板在扩增过程中会更快达到检测阈值，而拥有较小的CT值（Cycle Threshold）。反应结束后通过绘制对照DNA模板浓度与CT值的标准曲线即可计算目标模板初始的浓度，实现样品中DNA定量的目的。qPCR的应用包括单核苷酸多态性（SNP）检测、基因诊断、肿瘤载量及治疗效率检测等。

基于qPCR的RNA定量技术称为逆转录PCR（Reverse Transcriptase PCR），写为RT-PCR。（由于“实时”与“逆转录”的英文缩写均为RT，为避免混淆，通常“实时”小写为rt，“逆转录”大写为RT。）RT-PCR通过逆转录RNA形成互补DNA（Complementary DNA，cDNA）后以cDNA作为模板进行PCR扩增，可以应用于基因表达分析、病毒载量检测等。

模拟实验：标准RT-PCR法检测鼻咽样品中的新冠病毒

检测新冠病毒的引物和检测探针序列设计可以围绕包膜（Envelope，E）、核衣壳（Nucleocapsid，N）、RNA聚合酶（RdRp）或复制酶基因（ORF1ab），其中N和ORF1ab的序列在中国疾控中心的网站上有公开。

1. 使用鼻咽拭子在鼻粘膜或咽部采样，置于2mL病毒转移液（VTM）采样管中

2. 取采样后的样品液200μL使用RNA提取试剂盒提取样品，大量样品可以使用磁珠法病原微生物基因组核酸提取试剂盒及配套仪器自动提取。

3. 使用2.5×RT-qPCR预混液(多重-探针法）试剂盒中的预混液（10μL）与引物、探针（5μL）和提取样品（10μL）配置25μL反应体系，同步准备用于绘制标准曲线的参照体系。

4. 热循环仪的程序可大致设定为55℃ 5min逆转录，95℃ 5min预变性，45个扩增循环：95℃ 5sec、60℃ 15sec、72℃ 15sec。进行RT-PCR反应。

5. 最后用标准曲线计算样品中RNA模板的浓度，参照CT值标准判断是否阳性。

数字PCR（Digital PCR，dPCR）是基于终点PCR与qPCR发展而来的第三代核酸扩增技术，利用统计学方法实现核酸分子的绝对定量。数字PCR可以理解为将一个终点PCR体系分散成数以万计的微PCR反应，每个微系统体积为纳米级，且理论上仅含若干个、1或0个目标核酸分子。在热循环反应完毕后，用荧光检测系统记录微流控芯片上每个微系统的扩增情况，最后以泊松分布模型来计算初始体系中核酸分子的数量，可谓是生物分子检测与统计学的完美结合。dPCR已被广泛应用于临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测等领域。